基于分光光度计的奶茶中茶多酚的测定方法

基于分光光度计的奶茶中茶多酚的测定方法

在这项研究中，浊液中的比色变化特征可以通过以下方式确定 分光光度计.以酒石酸亚铁溶液为发色剂，在一定温度下测定无蛋白沉淀的奶茶中茶多酚的含量。探讨了奶茶的稀释比例、发色剂的用量、发色时间和发色温度对测定结果的影响，建立了用分光光度计测定奶茶及其他茶饮料中茶多酚含量的分析方法。结果表明，当奶茶的稀释比例为2倍，酒石酸亚铁溶液的加入量为10 mL，显色温度为25±1 ℃，显色时间为20 min时，试验结果最佳。该方法适用于奶茶及其他茶饮料中茶多酚的测定。茶多酚的线性范围为0.1～0.9mg，所得标准曲线的线性相关系数均在0.9815以上。样品的回收率为98.2%-107.9%，相对标准偏差（RSD）为1.7%-6.1%（n=6）。本研究建立的方法具有较高的精密度和准确度，适用于奶茶和其他茶饮料中茶多酚的测定。

茶饮料是人们喜爱的饮料之一，而茶多酚是奶茶的重要成分之一，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗辐射、调节肠道微生态等功能[1,2,3,4]。我国现行国家标准GB/T 21733-2008规定，调味茶饮料（奶及奶味）中的茶多酚含量应不低于200mg/kg，并详细描述了其检测方法，即茶饮料需经乙醇沉淀，过滤后得到透明样品，然后用酒石酸亚铁比色法测定[5]。

现有对茶饮料中茶多酚含量测定方法的研究主要集中在对国标方法中蛋白质沉淀环节的改进上。如杜建中[6]用无水乙醇和氯化钾固体来增强出盐效果，破坏饮料乳化体系，沉淀蛋白质等物质；梁瑞婷等[7]用醋酸作为沉淀剂，杜淑霞等[8]用酸性丙酮作为破乳剂和沉淀剂，获得清澈的溶液。但随着茶饮料加工技术的提高，通过添加优质乳化稳定剂和采用均质化技术，提高了奶茶等茶饮料体系的稳定性[9,10]，这也增加了沉淀蛋白获得清澈溶液的难度，从而对试验结果产生了不利影响。
利用紫外可见分光光度计和酒石酸亚铁比色法测定茶多酚含量的原理是：酒石酸亚铁溶液与沉淀的清液中的茶多酚反应，形成稳定的紫蓝色络合物，其特征吸收波长为540nm、而特征吸收波长的吸光度值与溶液中茶多酚的含量成正比，通过用紫外可见分光光度计测量样品在540纳米处的吸光度值，可以计算出体系中茶多酚的含量[11]。分光光度计使用色度值L、a和b来表示可见光区域的颜色变化，其中L代表黑色和白色（亮度），a代表红色和绿色，b代表黄色和蓝色[12,13,14]。分光光度计不仅可以准确测量溶液体系中的色度变化，还可以测量浊液体系中的色度变化，在苹果浊液的色度检测中得到了很好的应用[15]。奶茶作为一种茶饮料，具有奶和茶的双重营养，具有独特的风味和口感。它是茶饮料的一个重要代表。本研究用分光光度计测定了奶茶体系中茶多酚的含量。该方法的特点是奶茶样品不需要沉淀，可以减少样品预处理的复杂性，提高检测精度，降低检测成本。

1.材料和方法

1.1 材料和试剂

硫酸亚铁、酒石酸钾钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（分析试剂，天津大茂化学试剂厂）；没食子酸乙酯（分析试剂，上海麦克林生化科技有限公司）；市场上销售的奶茶饮料（东莞某超市）。

1.2 仪器和设备

ME104E分析天平（梅特勒-托利多集团，瑞士）； CS-500 手持式分光光度计杭州中新科技有限公司）；恒温加热磁力搅拌器（Heigoph，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂制备

酒石酸亚铁溶液[16]：称取0.1克硫酸亚铁和0.5克酒石酸钾钠到烧杯中，用少量蒸馏水溶解，转移到100mL容量瓶中，并在刻度上固定体积。随用随取。
1mg/mL茶多酚标准溶液：用没食子酸乙酯作为茶多酚的标准品[17]，在烧杯中准确称取250mg没食子酸乙酯，用少量蒸馏水溶解，转移到250mL容量瓶中，并在刻度上固定体积。随用随取。
PH=7.5的磷酸盐缓冲溶液[18]：称取23.87g的Na₂HPO₄ 称取9.08克KH溶液到烧杯中，用少量蒸馏水溶解，转移到1L容量瓶中，并将其体积固定在刻度上；称取9.08克KH₂坡₄ 溶液放入烧杯中，用少量蒸馏水溶解，转移到1L容量瓶中，并使其达到刻度；取850mL上述Na₂HPO₄ 溶液和150mL的KH₂坡₄ 溶液，并将其均匀地混合。

1.3.2 方法优化

• 1）奶茶稀释比例的优化。取一定量的奶茶，用蒸馏水稀释，得到稀释液A、B、C、D、E，稀释比例分别为1、2、4、6、8。取上述A、B、C、D、E稀释液2mL于50mL容量瓶中，各实验组加入0.4mL标准溶液、8mL蒸馏水、10mL酒石酸亚铁溶液，充分摇匀，用pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至刻度，于25±1℃下显色20min。在空白对照组中，用磷酸盐缓冲溶液代替标准溶液。
• 2）优化显色剂的加入量。取2mL奶茶稀释液B放入50mL容量瓶中，加入0.4mL标准溶液和8mL蒸馏水，分别加入5mL、10mL、15mL、20mL和25mL酒石酸亚铁溶液，摇匀，用pH7.5磷酸盐缓冲溶液稀释至体积，在25±1℃下显色20min。在空白对照组中，用磷酸盐缓冲液代替标准溶液。
• 3）显色时间优化。取2mL奶茶稀释液B放入50mL容量瓶中，加入0.4mL标准溶液，8mL蒸馏水，10mL酒石酸亚铁溶液，摇匀，用pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至刻度，在25±1℃下分别着色10min、20min、30min、40min和60min。在空白对照组中，用磷酸盐缓冲液代替标准溶液。
• 4）显色性温度优化。取2mL奶茶稀释液B放入50mL容量瓶中，加入0.4mL标准溶液、8mL蒸馏水、10mL酒石酸亚铁溶液，摇匀，用pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至体积，分别在5±1℃、25±1℃、37±1℃下显色20min。在空白对照组中，用磷酸盐缓冲液代替标准溶液。
• 用分光光度计测量上述实验组和空白组的色度值，并记录为L、a、b和L₀, a₀, b₀ 分别计算出△E值，并根据公示（1）进行计算。 

1.3.3 标准曲线的确定

1.3.2 标准曲线需要在不同的实验条件下测定，方法如下：取2mL奶茶稀释液放入50mL容量瓶中，加入8mL蒸馏水、一定量的酒石酸亚铁溶液、0.1-0.9mL标准溶液，用pH7.5磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，在一定温度下显色一定时间。在空白对照组中，用磷酸盐缓冲溶液代替标准溶液。计算实验组相对于空白组的色差值△E，并以△E为序数，以标准浓度为阴数画出标准曲线。

1.3.4 测定加标回收率

加药回收率的确定：将1.3.2中的每个△E代入标准曲线，得到加药含量的实验值X，并按下式计算加药回收率。

扣球的恢复率=5X/Y6 x100%

在公式中：X，没食子酸乙酯标准含量的实验值，单位：毫克；Y，没食子酸乙酯标准含量的理论值，单位：毫克。

1.3.5 奶茶中茶多酚含量的测定

将待测奶茶用蒸馏水稀释两次，取2mL奶茶稀释液放入50mL容量瓶中，加入8mL蒸馏水和10mL酒石酸亚铁溶液，摇匀，用pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至刻度，然后在25±1℃下着色20min。空白对照组中不加酒石酸亚铁溶液。计算实验组相对于空白组的色差△E，代入标准曲线，计算出待测奶茶中茶多酚的含量。

1.3.6 数据分析

所有实验均重复3次以上，数据以平均值±标准差表示。绘图采用Origin 9.1软件，数据处理采用SPSS 16.0软件，进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果和分析

2.1 奶茶稀释比例的优化

当奶茶的稀释比例较小时，体系中的茶多酚浓度较高，体系的颜色相关值的稳定性较差[19]。此时，奶茶体系中的干扰杂质浓度也较高[20]，影响了测定结果。如表1所示，当稀释比为2时，加标回收率为99.7±2.6%，与稀释比为4时的加标回收率无明显差异（P＞0.05），均接近100%。此外，该稀释比下的RSD值较小，试验的重现性较好。因此，在后续的测定过程中，奶茶的稀释释放比例为2倍。
表.1 奶茶稀释比例对茶多酚回收率的影响

奶茶的稀释比例	按比例的数量/毫升5毫克6	标准添加回收率 1%	RSD/%5n=66
1	0. 4	109.4±3.4ab	3. 2
2	0. 4	99.7 ± 2. 6bc	2. 6
4	0. 4	101.1 ± 9. 0bc	8. 9
6	0. 4	115.7 ± 14.3a	12. 3
8	0. 4	90.4 ± 8. 0c	9. 3

注：不同字母上的角痕有显著差异（P<0.05）。

2.2 优化着色剂的添加

表.2 加色试剂对茶多酚回收率的影响

显影剂的剂量/毫升	按比例的数量/毫升5毫克6	标准添加回收率 1%	RSD/%5n=66
5	0. 4	79.3 ± 6. 2b	7.9
10	0. 4	99.7 ± 2. 6a	2.6
15	0. 4	101.4±3.1a	3.1
20	0. 4	93.9 ± 5. 4a	5.7
25	0. 4	98.4 ±6. 5a	6.6

注：不同字母上的角痕有显著差异（P<0.05）。
如表2所示，当生色剂的用量从5mL增加到10mL时，加标回收率增加了20.4%（P0.05），均接近100%，但RSD值会随着生色剂含量增加而增加。当发色剂不足时，发色反应不完全，导致加标回收率的测量值较低。当生色剂的含量超过10mL时，测量值趋于稳定。为了避免过量的酒石酸亚铁对测定结果的影响，在后续的测定过程中，将生色剂的添加量设定为10mL。

2.3 优化显色时间

如表3所示，当显色时间为10min、20min和30min时，各组间的尖峰恢复率无明显差异（P>0.05），且接近100%。当显色时间超过30min时，随着显色时间的增加，加药的回收率逐渐下降。酒石酸亚铁与茶多酚结构中的儿茶酚羟基或焦儿茶酚羟基发生作用[21]。相互作用产物的形成和稳定性与时间密切相关。时间短，相互作用产物的形成不完全；时间过长，相互作用产物的结构可能发生变化，影响测定结果。当显色时间为20min时，加标回收率接近100%，RSD值相对较小，因此在后续测定过程中，显色时间为20min。
表.3 显色时间对茶多酚回收率的影响

显色时间/分钟	按比例的数量/毫升5毫克6	标准添加回收率 1%	RSD/%5n=66
10	0. 4	97.1 ± 10. 0ab	10. 3
20	0. 4	99.7 ± 2. 6a	3. 0
30	0. 4	105.3±6.0a	5. 7
40	0. 4	90.9 ± 2. 9b	3. 3
60	0. 4	74.6 ± 5. 0c	6. 7

注：不同字母上的角痕有显著差异（P<0.05）。

2.4 显色温度优化

如表4所示，在实验中选择的显色温度范围内，显色温度对尖峰的恢复影响不大。当显色温度为25±1℃时，加标回收率为99.7±2.6%，与37±1℃时的加标回收率无明显差异，且RSD值低，重现性最好。因此，选择25±1 ℃作为后续测定的显色温度。
表.4 色温对茶多酚回收率的影响

显色温度/℃	按比例的数量/毫升5毫克6	标准添加回收率 1%	RSD/%5n=66
5 ± 1	0. 4	87.8 ± 12. 9b	14. 8
25 ± 1	0. 4	99.7 ± 2. 6a	2. 6
37 ± 1	0. 4	104. 5 ± 6. 9a	6. 7

注：不同字母上的角痕有显著差异（P<0.05）。

2.5 恢复试验

在最佳实验条件下，即当奶茶的稀释比为2倍，发色剂用量为10 mL，发色时间为20 min，发色温度为25±1 ℃时，分别加入0.30、0.35、0.40、0.45、0。50 mL标准溶液，重复实验6次，标准品添加的平均回收率为98.2%-107.9%，相对标准偏差（RSD）为1.7%-6.1%（n=6），如表5所示。
表.5 茶多酚的回收率

按比例的数量/毫升5毫克6	标准添加回收率 1%	RSD/%5n=66
0. 30	106.8 ±2. 4	2. 3
0. 35	100.9 ±1. 8	1. 7
0. 40	99.7 ± 2. 6	2. 6
0. 45	98.2 ± 1. 7	1. 7
0. 50	107.9 ±6. 6	6. 1

2.6 奶茶中茶多酚含量的测定

以市售的1 #瓶装奶茶、2 #瓶装奶茶、3 #奶茶粉、4 #奶茶粉、5 #现制奶茶、6 #现制奶茶为样品，按照1.3.3的操作步骤绘制标准曲线（以1 #瓶装奶茶为例，见图1）。得到的标准曲线为y=6.4x+0.65，R²=0.9917(1 #); y=5.1253x+0.3694,R2=0.9822(2#); y=2.5717x+0.7058,R2=0.9941(3#); y=3.6301x+0.2049,R2=0.9815(4#); y=5.6936x+0.4814,R2=0.9843(5#); y=4.5533x+0.2335,R²=说明标准茶多酚在0.1-0.9mg范围内具有良好的线性关系。
根据1.3.5中的操作步骤，测定样品中茶多酚的含量（见表6）。各种市售奶茶的茶多酚含量：奶茶粉>瓶装奶茶>现制奶茶。

图1 没食子酸乙酯的标准曲线
表.6 奶茶中茶多酚含量的测定

奶茶样品编号	茶多酚含量/(mg/mL)
1#	0.48 ±0. 03
2#	0.54 ±0. 01
3#	1.34 ±0.06
4#	0.81 ±0. 02
5#	0.14 ±0. 02
6#	0.37 ±0. 03

3.总结

本研究用分光光度计测定了奶茶中茶多酚的含量。当奶茶的稀释比例为2倍，色度剂添加量为10mL，色度时间为20min，色度温度为25±1℃时，结果良好。该方法的平均回收率为98.2%-107.9%，相对标准偏差为1.7%-6.1%，具有较高的准确性和精确度。该方法效率高，成本低，克服了国标法中奶茶难以沉淀的缺点，避免了实验前的繁琐操作。适用于奶茶及其他茶饮料中茶多酚含量的测定。

作者姚家琪, 杨泽兵, 刘淑贤, 李玉婷, 陈俊儒, 叶然, 罗宣英, 杨国华

来源:中国 分光光度计制造商 - www.spectrumgfa.com

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